Démonstration de l'effet inhibiteur de protéines extraites de concrétions calcaires naturelles d'eau douce sur la précipitation du CaCO₃ in vitro

Evidence of inhibitory effect of proteins extracted from natural calcium deposits on calcium carbonate crystallization in vitro

¹ Laboratoire de Géomicrobiologie, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France
² Laboratoire de Physiologie-EPHE, Faculté de Pharmacie Paris XI, Chatenay-Malabry, France
³ Laboratoire de Biochimie A, Hôpital Necker, AP-HP, Paris, France

Résumé

Diverses bactéries d'eau douce ont été impliquées dans la formation de concrétions calcaires, mais les mécanismes mis en jeu et les molécules bactériennes engagées dans ces processus de cristallisation restent mal connus. Dans un précédent travail, nous avons montré que des bactéries du genre Bacillus, isolées à partir de concrétions calcaires naturelles, étaient capables d'engendrer la précipitation du carbonate de calcium lorsqu'elles étaient cultivées dans un milieu leur apportant du calcium. Sachant que beaucoup de processus de biominéralisation sont sous la dépendance de macromolécules, nous avons voulu vérifier si les bactéries favorisaient la précipitation du carbonate de calcium par l'intermédiaire de protéines. Pour cela, des concrétions calcaires recueillies dans la Seine et certains de ses affluents ont été déminéralisées avec l'EDTA afin d'en extraire les protéines. L'électrophorèse en gel de polyacrylamide des extraits a révélé la présence de quatre bandes protéiques majoritaires dont les masses moléculaires étaient comprises entre 11 000 et 35 000 daltons. Nous avons alors utilisé un modèle physico-chimique de cristallisation fondé sur la mesure de la radioactivité résiduelle d'une solution en présence et en absence des protéines extraites. Les résultats de ce modèle ont montré une activité inhibitrice importante de ces protéines vis-à-vis de la précipitation du carbonate de calcium.

Abstract

A number of freshwater bacteria have been implicated in crystallization of calcareous concretions. However, the precise mechanisms and the molecules involved in such processes remain poorly known. In a previous report, we provided evidence that bacteria belonging to the genus Bacillus could be isolated from natural calcareous concretions and were able to produce calcium carbonate crystals when cultured in vitro. It is well known that a variety of biomineralization processes require macromolecules, particularly proteins. We searched for the possible role of proteins in the formation of calcium carbonate deposits. Various concrements from the Seine river and some of its tributaries were demineralized using EDTA in order to extract proteins. Following demineralization, extensive dialysis was performed to remove salts and small molecules. The cut-off of the dialysis membrane was 3 000 daltons. Proteins were quantified using the Bradford's method. A polyacrylamide gel electrophoresis was performed on the extracts in regard of a protein extract from a Bacillus cereus strain. Four similar bands of proteins were observed for each extract and for Bacillus cereus too. The molecular mass of these proteins ranged from 11,000 to 35,000 daltons. Each protein extract was tested in an in vitro calcium carbonate crystallization model in presence of labelled 45Ca. Increasing quantities of the extracts were tested ranging from 0.05 to 2 μg. After a contact of the extract with the crystallization solution during one hour on stirring, the precipitate was removed by centrifugation. The residual radioactivity of the supernatant was measured and compared with the value of controls obtained in absence of proteins. The results of this experiment clearly demonstrated a strong dose-dependent inhibitory activity of the protein extracts against the calcium carbonate crystallization: the effect gradually increased in relation to the concentration up to a plateau, which was reached for 0.4 μg/ml of proteins.