Fiabilisation de l’analyse de legionella pneumophila dans les eaux résiduaires : évaluation de différentes méthodes de préparation d’échantillons

Towards reliable Legionella pneumophila analysis in wastewater samples: evaluating the impact of the sample preparation methods

¹ Suez Environnement – CIRSEE, 38 rue du Président Wilson, 78230 Le Pecq, France
² IPL - Santé Environnement Durables, Rue Cuenot, Parc St Jacques II. 54320 Maxeville, France
³ Institut Pasteur de Lille, 1 rue du Professeur Calmette - BP 245, 59019 Lille Cedex, France
⁴ Applus+ Labaqua, C/Dracma 16-18, Pol. Ind. Las Atalayas, 03114 Alicante, Spain

Résumé

La quantification de Legionella pneumophila dans les échantillons d’eaux résiduaires selon les méthodes normalisées existantes (normes NF T90-431 et XP T90-471, respectivement basées sur la mise en culture et la PCR quantitative) sont rendues difficiles, du fait notamment de l’hétérogénéité et la richesse en inhibiteurs (microorganismes susceptibles de générer une flore interférente et composés organominéraux inhibant l’amplification PCR). Or, la recherche des sources de contamination lors d’épisodes épidémiques de légionellose nécessite de disposer de méthodes fiables pour l’analyse de ce type de matrices. Sur la base de la méthode normalisée NF T90-431 (2003), les temps de contact et l ’ intensité des paramètres physico - chimiques (température, pH acide) instaurant une pression sélective favorable à la croissance des légionelles sur milieu de culture ont été optimisés. De même, l’application de la PCR quantitative sur ces matrices a nécessité l’évaluation et la comparaison de différents procédés d’extraction - purification d’ADN. Applicable en amont de la PCR, la séparation immunomagnétique (IMS), basée sur la reconnaissance spécifique antigène-anticorps, offre une solution alternative pour la concentration de L. pneumophila en permettant l’élimination d’une grande partie de la matière organique en suspension potentiellement inhibitrice de la PCR. Les développements analytiques ainsi obtenus permettront d’accéder à des matrices naturelles dont la complexité limitait le nombre d’analyses réalisées et empêchait jusqu’à présent de disposer de résultats fiables.

Abstract

The detection and quantification of Legionella pneumophila in waste water samples according to the existing standard methods (NF T90-431 and XP T90-471, respectively based on the cultivation and quantitative PCR) is made difficult, partly as a result of the diversity and richness in inhibitors (microorganisms that can cause interfering flora and organic compounds inhibiting the PCR amplification). However, the contamination sources tracking during epidemic outbreaks of Legionella diseases requires the availability of reliable methods for the analysis of such samples (raw and treated wastewater and activated sludge samples). Based on the standard NF T90-431 (2003), the contact time and intensity of physical-chemical parameters (temperature, acid pH) introducing selective pressure for the Legionella growth on culture media were optimized. The major improvements concerned the activated sludge matrix. By settling the suspension obtained after mechanical dispersion (Ultraturrax mixing) and by increasing the duration of treatment with heat and acid, the recovery and the quantification reproducibility of L. pneumophila were enhanced by limiting the growth of abundant microflora from 35 ± 2,4 % when classical pre-treatments were applied to 48 (± 4) % with optimized conditions. At the opposite, no solution could be found with respect to a strong inhibition effect observed in some cases for raw wastewater samples, independently of the effect of interfering microflora growth. For the application of quantitative PCR, five different DNA extraction – purification protocols (commercial kits and published references) were evaluated and compared on these samples. QiaAmp DNA stool mini kit (Qiagen) showed to be the most efficient for L. pneumophila PCR quantification (in terms of recovery and reproducibility as well as PCR inhibitors removing). Otherwise, a specific immunomagnetic separation (IMS), based on the antigenantibody specific recognition represents an interesting alternative for the concentration of L. pneumophila. When applied upstream of PCR, IMS allows to simplify the analyse and to reduce the delay before getting results. However, IMS failed to enhance L. pneumophila quantification by culture. Thus, resulting developments will enable access to the occurrence of L. pneumophila in natural matrices whose complexity limiting the number of tests carried out so far prevented and to have reliable results.