Amélioration de la détection des parasites Cryptosporidium et Giardia par cytométrie de flux. Application à des échantillons d'origine hydrique

Improved detection of Giardia cysts and Cryptosporidium oocystes in water by flow cytometry

Anjou-Recherche. Graal - Département de Recherche en Microbiologie 109-111, rue des Côtes - 78600 Maisons-Lafitte

Résumé

Les oocystes de Cryptosporidium et les kystes de Giardia d'origine hydrique présentent des caractéristiques morphologiques et de marquage beaucoup plus hétérogènes que celles des suspensions purifiées. L'analyse et le tri cytométrique des échantillons dépendant directement de la qualité du marquage immunofluorescent, deux jeux des fenêtres de sélections ont donc été définis afin d'évaluer le degré de contamination des eaux : l'un de sélectivité élevée (FL1 602), l'autre de spécificité plus large (FL1 500), élaboré à partir de la fenêtre de sélection FL1 602 agrandie. L'application de la fenêtre de tri FL1 602 à la détection des parasites présents dans des échantillons d'eau de surface induit généralement une sous estimation de la concentration en parasites. Celle-ci est d'environ 20 % pour les suspensions d'oocystes purifiés, vieillis pendant plusieurs mois à 4°C. Seules les fenêtres de sélection FL1 500 permettent, pour les différents types d'eau que nous avons analysés, et pour les suspensions purifiées de parasites, d'obtenir des dénombrements équivalents, voire supérieurs à ceux obtenus par la méthode de lecture directe. Les résultats des dénombrements effectués après tri cytométrique en FL1 500 sur des eaux de surface et des eaux en cours de potabilisation, indiquent que l'utilisation du cytomètre de flux couplé à un trieur de cellules : - facilite la lecture microscopique, - permet d'analyser, pour des temps d'observation identiques, des volumes de concentrats au moins 10 fois plus importants que par la technique classique, - améliore la reproductibilité et fiabilité des résultats, - permet d'envisager les tests de viabilité/infectivité et de typage génétique spécifique aux espèces pathogènes pour l'homme.

Abstract

Cryptosporidium parvum and Giardia duodenalis are two major protozoan responsible of acute gastroenteritis of parasitic origin in North America and Europe.

Although water is not the major route of transmission, there have been several documented waterborne outbreaks of Cryptosporidiosis and Giardiasis in USA and in UK in recent years and the risk of infection is even greater for individuals with immunodeficiency symptoms. Therefore water treatment industries need to develop accurate analytical methods in order to estimate the efficiency of water treatment processes.

The major drawbacks of the immunofluorescent assay method including filtration, concentration, flotation and microscopic identification of Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts are the low recovery of the technique and the lack of precision of the quantification linked to the microscopic observation which is tedious, time consuming and occluded by the presence of contaminating debris, micro-organisms, autofluorescing particles, algae... The aim of this study was to evaluate the use of flow cytometry in order: - to facilitate microscopic observations, - to improve by cell sorting the reproducibility of microscopic countings and - to have more representative data by analysing larger volumes of concentrates.

Most of this work dealt with the optimisation of flow cytometric cell sorting conditions (fluorescence intensity, granularity, size of particles) for Giardia and Cryptosporidium present in stock solutions and concentrates from naturally contaminated water samples (raw or partially treated) collected from various locations in France.

Quantifications were done by fluorescent microscopic countings before and after cell sorting using a Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer. The preliminary settings (FL1 602) established with fresh stock solutions showed 100% recovery by comparison with countings without sorting. However those settings could lead to an 80% recovery of the oocystes from old stock solutions and to a 7 (table 2) to 10 fold (data not shown) underestimation of the presence of parasites in surface water concentrates.

Refining the acquisition gate (FL1 500) led to equivalent or improved countings of cysts and oocysts in old purified stock solutions, and in raw and partialy treated water, except when the level of contamination was very low (< 0,1 (oo) cysts/l), as the analysis is then submitted to random biodistribution problems of the particles within the water concentrat. This protocol led to microscopic countings after flow cytometry cell sorting 2 to 6 fold more reliable than recorded by direct counts.